Orellana murió en su segundo intento de conquistar el Amazonas

Lejos de descansar tras su primera hazaña, Orellana convenció al rey Carlos I de financiar una segunda expedición para colonizar las tierras del Amazonas. Partió en 1544 con cuatro barcos y más de 500 personas. La expedición fue un desastre desde el principio: naufragios, enfermedades, motines y la propia selva diezmaron a los colonos. Orellana murió en el Amazonas en 1546, probablemente de enfermedad, sin haber logrado establecer ningún asentamiento permanente.