Volvió ocho años después para colonizar Florida y murió por una flecha envenenada de los calusa

En 1521, Ponce de León regresó a Florida con dos naves, unos 200 colonos, semillas, ganado y caballos, decidido a fundar el primer asentamiento español permanente en el territorio. Los indígenas calusa, que ya se habían enfrentado a expediciones españolas anteriores, atacaron al grupo casi de inmediato. Una flecha, posiblemente envenenada con savia de manzanillo, le alcanzó en el muslo. Ponce de León ordenó abandonar el intento de colonización y regresó a Cuba, donde murió semanas después a causa de la herida, sin haber encontrado ni oro ni juventud eterna, pero habiendo abierto a España el camino hacia Norteamérica.